Vier New Yorker Zootiere – das abenteuerliebende Zebra Marty, der eitle Löwe Alex, die hypochondrische Giraffe Melman und die divenhafte Nilpferddame Gloria machen nach Martys 10. Geburtstag die Straßen außerhalb des Central Park Zoos unsicher. Erst kurz zuvor war der vorlaute Marty von den vier Pinguinen Skipper, Private, Kowalski und Rico zu diesem Fluchtplan überredet worden, denn eigentlich stehen Gloria, Melman und Alex, alle im Zoo verwöhnt, diesem Vorhaben sehr skeptisch gegenüber. Nach einer langen Nacht, die sie vor allem auf der Flucht vor der Polizei verbringen, finden sich die vier Freunde sowie die Gruppe der Pinguine in Holzkisten auf einem Schiff in Richtung Kenia wieder.
Nachdem die verschwörerischen Pinguine die Steuerung des Schiffes übernehmen, stranden Alex, Marty, Melman und Gloria auf Madagaskar. Bald merken die verwöhnten Tiere, wie es wirklich ist, in der Wildnis zu leben. Schnell lernen sie eine Gruppe Lemuren kennen, die zuerst ängstlich sind, vor allem wegen des Raubtieres Alex, doch schnell merken, dass sie von ihnen nichts zu befürchten haben.
Julien, der König der Lemuren, plant schon, die „New York Giants“ als Verteidigung gegen die Fossas einzusetzen.
Alles ändert sich aber, als Alex hungriger und hungriger wird, sich an seinen Jagdtrieb erinnert und keine Hemmungen mehr hat, sogar seine Freunde anzuknabbern. Am liebsten aber möchte er einfach nach Hause in den Zoo im Central Park, um regelmäßig gefüttert zu werden und seinen Starruhm zu genießen.
Am Ende gelingt es den Freunden, sowohl Alex’ Fresstrieb mit Fisch in den Griff zu bekommen, als auch den Fossas zu entkommen. Da die Pinguine inzwischen wieder aus der Antarktis zurückgekehrt sind, bereitet sich die Truppe auf die Abfahrt in den Zoo vor. Allerdings ist der Tank des Schiffes leer.
